第一步：選擇與準備

　　根據(jù)目標分子的性質(zhì)（大小、電荷、疏水性、特異性結(jié)合位點）選擇合適的層析介質(zhì)（如Ni-NTA用于His標簽蛋白、DEAE用于陰離子交換）與柱型（預(yù)裝柱或自裝柱）。確認柱體積（如0.5mL、1mL）與樣品量匹配，避免過載。檢查柱體有無裂紋，出口是否通暢。

　　第二步：平衡

　　使用至少5-10倍柱體積（CV）的平衡緩沖液以恒定流速沖洗層析柱，使固定相充分溶脹并達到pH、離子強度的穩(wěn)定狀態(tài)。確保流出液的pH與電導(dǎo)率與平衡液一致，表明柱床已平衡。此步驟對分離分辨率至關(guān)重要。

　　第三步：上樣

　　樣品需預(yù)先離心或過濾（0.22μm），去除顆粒物，防止堵塞柱床。

　　樣品體積通常不超過柱體積的1%-5%（體積比），濃度過高易導(dǎo)致拖尾。

　　用移液器沿柱壁緩慢加入樣品，避免擾動柱床表面。

　　讓樣品進入柱床后，再加入少量平衡液沖洗進樣環(huán)，確保樣品全部加載。

　　第四步：洗滌

　　用3-5CV的洗滌緩沖液（通常與平衡液相同或略增鹽濃度）洗去未結(jié)合的雜蛋白或非特異性吸附物。收集流出液，可通過SDS-PAGE或紫外吸收檢測雜質(zhì)去除效果。

　　第五步：洗脫

　　根據(jù)層析類型選擇洗脫方式：

　　梯度洗脫：使用線性或階梯式鹽梯度（如NaCl0-1M）或咪唑梯度，逐步競爭性洗脫結(jié)合分子，分辨率高。

　　等度洗脫：用高濃度洗脫液一次性洗下目標分子，操作簡單但可能共洗出雜質(zhì)。

　　特異性洗脫：如用還原型谷胱甘肽洗脫GST標簽蛋白。

　　以小體積（如0.5-1mL/管）分步收集洗脫液，及時進行檢測（如Bradford法、A280測定）。

　　第六步：再生與保存

　　再生：洗脫后，用強洗脫液（如1MNaOH、6M胍鹽）清洗柱子，去除殘留蛋白，恢復(fù)結(jié)合能力。

　　保存：短期存于20%乙醇或平衡液中4℃；長期保存用含20%-50%乙醇的溶液，防止微生物滋生。

　　第七步：流速控制

　　使用恒流泵或重力滴加，保持流速穩(wěn)定（如1mL/min）。過快降低分辨率，過慢延長實驗時間。避免產(chǎn)生氣泡。